A CLOROQUINA FUNCIONA?

Quando começou a pandemia da Covid, pesquisadores do mundo inteiro se mobilizaram em busca de antivirais. Remédios utilizados para outras doenças e com algum efeito antiviral começaram a ser testados. Entre esses, a cloroquina, usada contra a malária, mostrou-se altamente eficaz no controle da infecção pelo coronavírus in vitro. Ou seja, quando aplicada em culturas de células infectadas, a droga conseguiu bloquear a multiplicação do vírus. 

Com esse resultado promissor os pesquisadores chineses, tendo realizado o experimento, sugeriram que o medicamento fosse avaliado em pacientes humanos infectados pelo novo coronavírus [1].

Relatos da eficácia do uso da cloroquina e do seu derivado hidroxicloroquina por diversos médicos e em determinados estudos, principalmente o liderado pelo pesquisador francês Didier Raoult [2], levaram muitos profissionais e até políticos a defenderem o uso da droga [3, 4]. Posteriormente, surgiram outros estudos que também apontavam um efeito positivo da droga contra a Covid, como foi o caso de um realizado no Sistema de Saúde Henry Ford, em Detroit, Michigan [5].

A avaliação segura de um medicamento deve ser feita por meio de ensaios clínicos seguindo procedimentos que minimizem as interferência nos resultados, ou seja, de estudos randomizados controlados (RCT, do inglês Randomized Controlled Trial). 

Grupos não randomizados podem ter predominância de determinada característica, ocasionando vieses nos resultados.
A randomização (distribuição ao acaso) permite deixar os grupos similares, evitando vieses.

Há ainda outros procedimentos, como o uso de placebo e duplo-cego, que melhoram mais a qualidade do estudo (veja aqui).  

Os estudos de Raoult, do Sistema de Saúde Henry Ford e muitos outros não usaram um dos critérios mais básicos, que é a aleatorização das amostras (estudo randomizado). O de Raoult ainda apresentou outros problemas (veja aqui). A não aleatorização pode levar a interpretações erradas, pois se comparamos um grupo com predominância de jovens recebendo o medicamento e outro mais idoso como controle, poderemos ter um viés nos resultados. Outros fatores predominantes em um dos grupos testados e ausentes no outro também podem interferir. Foi exatamente isso que ocorreu com o estudo do Sistema de Saúde Henry Ford (veja aqui). A aleatorização (randomização) evita esse viés e mistura aleatoriamente os dois grupos que serão testados. 

Por outro lado, estudos controlados randomizados (RCT) mostraram ineficácia do medicamento em pacientes hospitalizados [6]. Há quase um consenso de que a cloroquina e hidroxicloroquina não devam ser administradas para casos avançados da doença. No entanto, muitos médicos e pesquisadores têm defendido o uso da cloroquina e hidroxicloroquina (associada a outros medicamentos) precocemente, ou seja, na fase inicial da doença. Existem cinco estudos controlados randomizados (RCT) sobre o uso precoce da hidroxicloroquina e, em nenhum deles, foram encontradas diferenças significativas em prol do uso da droga  [7, 8 , 9, 10, 11].  Na realidade, todos os cinco estudos indicam efeito de redução nas respostas (infecção, hospitalização e/ou morte) com o uso do da hidroxicloroquina, mas tais diferenças não têm significância estatística. Ou seja, as diferenças mínimas encontradas podem ser atribuídas ao acaso.  

No entanto, uma meta-análise (técnica estatística adequada para combinar resultados provenientes de diferentes estudos) desses cinco ensaios indica diferenças estatísticas [12]. Assim, segundo os pesquisadores responsáveis por esse estudo, os dados desses cinco ensaios controlados e randomizados mostram, conjuntamente, vantagem no uso da hidroxicloroquina. Porém, o próprio líder do estudo, Harvey Risch, reconhece um ponto fraco dessa meta-análise, uma vez que que infecções, hospitalizações e mortes foram agrupadas em um “resultado composto” [13]. Combinar todos esses eventos em um grande número torna mais provável que os pesquisadores obtenham um efeito significativo estatisticamente (veja mais aqui). 

A ausência ou incerteza de uma ação antiviral da cloroquina e hidroxicloroquina são incongruentes com os resultados in vitro, que mostraram alta efetividade para evitar a infecção pelo vírus. 

CÉLULAS ERRADAS

O experimento in vitro realizado pelos pesquisadores chineses utilizou a cultura de células chamadas Vero E6 [1]. Essas células são provenientes do rim do macaco africano Chlorocebus aethiops. Culturas com esse tipo de células são úteis e frequentemente usadas pelos virologistas porque permitem o crescimento de uma ampla variedade de vírus. No entanto, um estudo realizado por pesquisadores alemães do Centro de Primatas em Göttingen [14] verificou que a forma como o coronavírus (SARS-CoV-2) infecta as células renais de macacos é diferente da maneira como faz com as células pulmonares humanas.

Cultura de células Vero E6 são originadas do rim do macaco africano Chlorocebus aethiops. A cultura de células Calu-3 é produzida a partir de células do epitélio do pulmão dos humanos Homo sapiens.

Para infectar diferentes tipos de células, o coronavírus tem pelo menos duas vias principais de entrada possíveis.

Em uma delas, o vírus entra nas células por meio de compartimentos celulares especiais chamados endossomos. Depois de se ligar ao receptor ACE2 da membrana celular, o vírus é engolfado por um endossomo, mas o patógeno precisa retirar seu material genético (RNA) desse compartimento e colocá-lo no citoplasma da célula. Para isso, é necessário que a proteína spike seja clivada pela enzima catepsina, permitindo que as membranas viral e celular se fundam liberando, assim, o material genético do vírus. 

Na outra via, a proteína spike do vírus se liga à proteína ACE2 na membrana celular e, em seguida, uma enzima chamada TMPRSS2 corta a proteína spike. Esse processo permite que o vírus injete seu material genético na célula, onde mais cópias do vírus são produzidas.

O coronavírus SARS-CoV-2 pode entrar nas células por pelo menos duas vias. Em uma via (à esquerda), o vírus se liga ao ACE2 e, em seguida, a célula envolve o vírus em um compartimento denominado endossomo.  Após essa etapa, a catepsina quebra a proteína spike, permitindo a fusão do vírus com a membrana e a transferência do material genético (RNA) do vírus para o citoplasma da célula. Em outra via (à direita), a enzima TMPRSS2 corta a proteína spike, fazendo com que as membranas celular e viral se fundam, permitindo que o material genético do vírus escape diretamente para o citoplasma da célula. Adaptado de “Hydroxychloroquine can’t stop COVID-19. It’s time to move on, scientists say”. Science News.

Em células Vero de macacos, o coronavírus usa a via dos endossomos. Mas a enzima catepsina precisa de um certo nível de acidez para fazer o corte da proteína spike. Nas células dos tecidos respiratórios humanos há a presença da enzima TMPRSS2 [15] e o coronavírus segue o caminho mais direto usando essa enzima, que não é encontrada nas células do macaco.

A hidroxicloroquina e a cloroquina aumentam muito o pH (ou seja, diminuem a acidez), impedindo que a catepsina corte a proteína SPIKE. Dessa forma, essas drogas inibem a infecção nas células do macaco. Quando os pesquisadores testaram as drogas em células pulmonares humanas cultivadas em placas de laboratório (Calu-3), o vírus penetrou facilmente nas células. Isso porque, nas células pulmonares, o coronavírus segue o caminho mais direto usando o TMPRSS2 que a cloroquina e a hidroxicloroquina não inibem.

A catepsina, que quebra a proteína spike, é debilitada pela hidroxicloroquina nas células renais dos macacos, inibindo uma infecção.
A rota de entrada em células do pulmão humano, via enzima TMPRSS2, não é bloqueada pela hidroxicloroquina.

Outro estudo desenvolvido por pesquisadores franceses chegou ao mesmo resultado, mostrando que a hidroxicloroquina inibe a infecção por coronavírus das células Vero de macaco, mas não das células do pulmão humano [16]. 

Aplicação crescente de cloroquina e a quantidade de vírus detectada em cultura de células de rim do macaco Chlorocebus aethiops (Vero), à esquerda, e em cultura de células de pulmão humano (Calu-3), à direita. Extraído de Nature 585, página 589.

No início tínhamos testes em culturas de células de macacos que indicavam um efeito promissor da cloroquina/hidroxicloroquina para bloquear a replicação do coronavírus. O uso em pacientes com Covid provocou inúmeras controvérsias sobre o uso da droga para combater a doença. Agora novos testes mostram que cloroquina/hidroxicloroquina não impedem a multiplicação do coronavírus em culturas de células do trato respiratório humano. Aos poucos a ciência vai saneando as dúvidas por ela mesma criada!  

REFERÊNCIAS

[1] – Wang, M., Cao, R., Zhang, L. et al. 2020. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res 30, 269–271. https://doi.org/10.1038/s41422-020-0282-0

[2] – Gautret P, Lagier JC, Parola P, et al. 2020. Hydroxychloroquine and azithromycin as a treatment of COVID-19: results of an open-label non-randomized clinical trial. Int J Antimicrob Agents. 2020;56(1):105949. doi:10.1016/j.ijantimicag.2020.105949

[3] – Ferner, R. E. & Aronson, J. K. 2020. Chloroquine and hydroxychloroquine in covid-19. Br. Med. J. 369, m1432.

[4] – Lenzer, J.  2020. Covid-19: US gives emergency approval to hydroxychloroquine despite lack of evidence. BMJ2020;369:m1335. doi:10.1136/bmj.m1335pmid:32238355

[5] – Arshad S, Kilgore P, Chaudhry ZS, et al. 2020. Treatment with hydroxychloroquine, azithromycin, and combination in patients hospitalized with COVID-19. Int J Infect Dis. 2020;97:396-403. doi:10.1016/j.ijid.2020.06.099

[6] – Horby, P.,  Mafham, M, Linsell, L, Bell, J. L. et al, 2020. Effect of Hydroxychloroquine in Hospitalized Patients with COVID-19: Preliminary results from a multi-centre, randomized, controlled trial medRxiv 2020.07.15.20151852; doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.15.20151852

[7] – Mitjà O, Ubals M, Corbacho-Monné M, et al. 2020. A cluster-randomized trial of hydroxychloroquine as prevention of COVID-19 transmission and disease. Preprints July 26, 2020. https://doi.org/10.1101/2020.07.20.20157651

[8] – Mitjà O, Corbacho-Monné M, Ubals M, et al. 2020. Hydroxychloroquine for early treatment of adults with mild COVID-19: A randomized-controlled trial. Clin Infect Dis 2020 Jul 16:ciaa1009. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa1009

[9] – Boulware, M. D., Matthew M. P. H., Pullen,  F. et al. 2020. A Randomized Trial of Hydroxychloroquine as Postexposure Prophylaxis for Covid-19. The New England Journal of Medicine 383:517-525. https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2016638#article_citing_articles  

[10] – Rajasingham R, Bangdiwala AS, Nicol MR, et al. 2020. Hydroxychloroquine as pre-exposure prophylaxis for COVID-19 in healthcare workers: a randomized trial. Preprints September 21, 2020. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.09.18.20197327v1

[11] – Skipper, C. P., Katelyn M.D., Pastick, A. 2020. Hydroxychloroquine in Nonhospitalized Adults With Early COVID-19. Annals of Internal Medicine https://www.acpjournals.org/doi/10.7326/M20-4207

[12] – Ladapo, J. A., McKinnon, J. E.,  McCullough, P. A., Risch, H. A. 2020. Randomized Controlled Trials of Early Ambulatory Hydroxychloroquine in the Prevention of COVID-19 Infection, Hospitalization, and Death: Meta-Analysis (não publicado) medRxiv 2020.09.30.20204693; doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.30.20204693

[13] – Maybe too soon to rule out hydroxychloroquine; tricking the immune system. Reuters,  HEALTHCARE & PHARMA https://www.reuters.com/article/us-health-coronavirus-science-idUSKBN26N3F1

[14] – Hoffmann, M., Mösbauer, K., Hofmann-Winkler, H. et al. 2020. Nature 585, 588–590 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2575-3

[15] – Iwata-Yoshikawa N, Okamura T, Shimizu Y, Hasegawa H, Takeda M, Nagata N. 2020. TMPRSS2 Contributes to Virus Spread and Immunopathology in the Airways of Murine Models after Coronavirus Infection. J Virol. 2019;93(6):e01815-18. Published 2019 Mar 5. doi:10.1128/JVI.01815-18

[16] – Maisonnasse, P., Guedj, J., Contreras, V. et al. 2020. Hydroxychloroquine use against SARS-CoV-2 infection in non-human primates. Nature 585, 584–587 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2558-4

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